Pracownia PCR i qPCR
Bardzo bogato wyposażona i częściowo zautomatyzowana pracownia umożliwia prowadzenie wielu niezależnych oznaczeń w tym samym czasie. W skład wyposażenia pracowni wchodzą:
– stacja pipetująca epMotion 5075,
– zestaw do ddPCR składający się z urządzeń: generator kropli qX 200, zaklejarka do płytek wielodołkowych, – termocykler T100 oraz czytnik kropli QX200,
– termocykler do qPCR: Lightcycler 96,
– termocykler eppendorf vapo.protect,
– termocykler dwublokowy C1000,
– nablatowa komora laminarna,
– drobny sprzęt: chłodziarka, zamrażarka, miniwirówki, wytrząsarki oraz trzy zestawy pipet o zmiennej objętości.
Start
Oferta laboratorium
Pracownie wykorzystywane są przede wszystkim na potrzeby prowadzonych w Katedrze Chorób Ptaków badań naukowych. Jednakże Katedra świadczy również usługi dla podmiotów zewnętrznych oferując szeroki zakres diagnostyki molekularnej wirusów (w niektórych przypadkach z podziałem na podtypy), bakterii oraz pierwotniaków. Ponadto możliwe jest oznaczanie płci ptaków (wybrane gatunki) metodami molekularnymi oraz wykrywanie markerów genetycznych u ptaków reprodukcyjnych wybranych gatunków. Katedra Świadczy również usługi opracowywania de novo metod diagnostyki molekularnej wybranych patogenów zgodnie z wytycznymi klienta.
Laboratorium Diagnostyki Molekularnej Chorób Zakaźnych ptaków
Kontakt do laboratorium
dr hab. wet. Tomasz Stenzel, prof. UWM
tel. 89 523 38 11, e-mail: tomasz.stenzel@uwm.edu.pl
Charakterystyka aparatury
Zestaw składa się z Generatora kropli QX200, zgrzewarki do płytek wielodołkowych (PX1 PCR plate sealer), termocyklera C 1000 Touch oraz czytnika kropli QX200.
Genrator kropli QX200 wykorzystuje mikroprzepływy do łączenia oleju i wody (próbka) w celu wytworzenia emulsyjnych kropel wymaganych do analizy ddPCR. Po wytworzeniu kropel, próbki przenosi się na standardową 96-dołkową płytkę do PCR i zakleja za pomocą zgrzewarki PX1. Zgrzaną płytkę poddaje się amplifikacji w termocyklerze C1000. Po przeprowadzeniu PCR należy załadować płytkę do czytnika kropel QX200. Urządzenie to umożliwia pobranie każdej próbki, rozdzielenie kropel i ich strumieniowy przesył przez detektor dwukolorowy. Detektor służy do odczytania każdej kropli i określenia, tych, w których znajdują się amplikony. Następnie mogą być one poddane analizie ilościowej.
Możliwości badawcze
Zestaw do ddPCR QX200 pozwala wykryć w badanej próbce określone odcinki kwasów deoksyrybonukleinowych i dokonać ich absolutnej oceny ilościowej. Jest to emulsyjno-kropelkowa technologia, która opiera się na frakcjonowaniu pojedynczej próbki na 20 000 kropli. W każdej z tych kropli przebiega niezależny PCR, umożliwiając czułą i precyzyjną detekcję obecności w każdej z nich nawet pojedynczej cząsteczki DNA. System przy pomocy czytnika i użyciu barwników fluorescencyjnych (EvaGreen, FAM, HEX) sczytuje cząsteczki w których doszło do amplifikacji produktu ddPCR (dodatnie) i wszystkie pozostałe (negatywne), w oparciu o które generuje się bezwzględną liczbę cząsteczek dodatnich w próbce, bez konieczności odniesienia do krzywych standardowych czy genu referencyjnego (w przeciwieństwie do klasycznego qPCR). Metoda ta nie wymaga powtórek technicznych próbek, a wynik nie zależy od wydajności reakcji.
Charakterystyka urządzenia
Komora dwustanowiskowa do PCR. Urządzenie zapewnia ochronę przed kontaminacją próbek materiału genetycznego. Duża powierzchnia robocza, zamknięty system (szyby) oraz bezozonowa dekontaminacja promieniami UV po zakończonej pracy zapewnia biobezpieczeństwo.
Możliwości badawcze
Urządzenie wykorzystywane jest do przygotowania PCR we wszystkich wariantach. W urządzeniu przeprowadzany jest etap przygotowywania mieszaniny reakcyjnej.
Wszystkie termocyklery umożliwiają przeprowadzenie reakcji z zastosowaniem gradientu temperaturowego. Termocyklery T100 oraz vapo.protect wyposażone są w 96 dolki grzewcze, z kolei termocykler C1000 wyposażony jest w system dwublokowy, co umożliwia prowadzenie 2 niezależnych reakcji o różnych profilach temperaturowych jednocześnie. Powyższe rozwiązanie bardzo dobrze sprawdza się w usługowych badaniach diagnostycznych.
LightCycler 96 jest urządzeniem służącym do przeprowadzania ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym w 96 dołkowych płytkach. Aparat wyposażony w cztery kanały detekcji o następującym układzie filtrów wzbudzających /detekcyjnych: 470 / 514nm; 533 / 572nm; 577 / 620nm; 645 / 697,5nm. System pozwala na analizę kwasów nukleinowych przy pomocy różnych barwników i sond molekularnych (SYBR Green I, LC Green, ResoLight Dye, sondy hydrolizujące typu TaqMan). Przekazywanie sygnału fluorescencyjnego z prób do systemu detekcyjnego dokonuje się za pośrednictwem światłowodów. Urządzenie to umożliwia analizę ilości kopii fragmentu DNA w badanej próbie, pomiar poziomu ekspresji badanego genu, analizę krzywych topnienia (High Resolution Melting) pozwalającą na identyfikację polimorfizmu typu SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Light Cycler 96 wyposażony jest w moduł do analizy genotypowania typu end-point przy pomocy sond hydrolizujących do wykrywania mutacji.